Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. 1996-99

I. Живые нити.

Ю. М. ВАСИЛЬЕВ.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

1. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 3. Клетка единая, но делимая // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. № 8. С. 18-23.

2. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 1. Живые нити//Там же. 1996. № 2. С. 36-43.

3. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 2. Ци-тоскелет, способный чувствовать и помнить // Там же. № 4. С. 4-10.

THE CELL AS A MIRACLE OF ARCHITECTURE

I. LIVING FIBRILS

YU. M. VASIL'E

This paper discusses the principles of the organiza­tion of cytoskeleton, that is, ot the system ot three types of protein fibrils responsible for the shape and mobility of a cell. It is shown that depolymerization and poly­merization of these fibrils is the basis of cytoskele­ton dynamics. Molecular mechanisms of cytoskeletal fibrils movement and of cel­lular organelles movement along these fibrils are described. Examples of dif­ferent constructions being built in a cell from these fibrils are given.

В статье разбираются принципы организации цитоскелета - системы из трех типов белковых ни­тей, определяющих фор­му и подвижность клетки. Показано, что основа ди­намики цитоскелета -по­лимеризация и деполиме­ризация нитей. Описаны молекулярные механиз­мы движений нитей цито­скелета и движений кле­точных органелл вдоль этих нитей. Приведены примеры разнообразных конструкций, которые строятся в клетке из этих нитей.

ВВЕДЕНИЕ

Каждый знает, что наш организм есть федерация огромного множества отдельных клеток. Однако мы часто недооцениваем тот простой факт, что каж­дая из этих клеток - сложный индивидуум, облада­ющий собственными принципами поведения. Если не понять эти принципы, нельзя разобраться во вза­имодействиях клеток в организме. Изучать поведе­ние отдельных клеток лучше всего, пользуясь мето­дом клеточных культур, то есть выделяя отдельные клетки из организма и помещая их в сосуд с пита­тельной средой. Если наблюдать эти клетки под ми­кроскопом и фиксировать их поведение на кино-или видеопленке, то легко убедиться в том, что каж­дая клетка в такой культуре живет самостоятельной сложной жизнью: прикрепляется ко дну сосуда и ползает по этому дну (подложке), меняя свою фор­му и направление движения, выбрасывая и втягивая отростки. Внутри клеток отдельные пузырьки-органеллы все время движутся. Долго казалось, что ра­зобраться в механизмах этого сложного поведения клеток и их частей почти невозможно.

Замечательное достижение последних десятиле­тий - открытие и исследование системы структур, ответственных за подвижную архитектуру клетки, за ее движения и форму. Этой системой в клетках эукариот оказался цитоскелет - система белковых нитей, наполняющих цитоплазму (рис. 1). В этой статье я попытаюсь кратко рассказать о том, как ор­ганизован цитоскелет, каковы основные типы его конструкций.

ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ И ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИЯ НИТЕЙ - ОСНОВА ДИНАМИКИ ЦИТОСКЕЛЕТА

Цитоскелет состоит из трех основных типов ни­тей, образующих три системы: микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные филаменты. Каждый тип нитей состоит из одного-двух основ­ных белков: микрофиламенты - из актина, микро­трубочки - из тубулина, промежуточные филамен­ты - из специальных белков, различных в разных тканях: кератинов - в эпителиях, десмина - в мыш­цах, виментина - в тканях внутренней среды (со­единительной ткани, хряще, кости и др.), белков нейрофиламентов - в нейронах.

Рис. 1. Сеть актиновых микрофиламентов в цито­плазме культивируемой клетки (фибробласта). Микрофотография с трехмерной реплики цитоскелета под электронным микроскопом. Увеличе­ние 45000х. Уменьшение при печати в 1.6 раза. ПрепаратТ.М. Свиткиной.

Разумеется, белки цитоскелета, как и любые

и деполимеризация молекул регулируются разными актинсвязывающими белками. Некоторые из таких белков присоединяются к одному концу нити, бло­кируя на этом конце полимеризацию и деполиме­ризацию, тогда рост и укорочение микрофиламента идут лишь на другом конце, не закрытом блоки­рующим белком. Некоторые специальные белки соединяют несколько мономеров в "зачаток" ни­ти, вызывают нуклеацию нового микрофиламен­та. В дальнейшем такие нити растут в одну сторону, обычно в сторону плюс-конца. Специальные белки могут присоединяться к бокам нескольких микро-филаментов. При этом одни белки связывают мик-рофиламенты в сети, другие - в пучки.

Особую роль среди актинсвязывающих белков играют миозины, так как они могут двигаться по микрофиламенту. В настоящее время известна структура свыше 80 вариантов молекул миозинов. У всех миозинов молекула состоит из трех частей: головки, шейки и хвоста. Головка способна присое­диняться к боку актинового микрофиламента, и ес­ли снабжать эти головки поставляющим химичес­кую энергию веществом - АТФ, то головка движется вдоль микрофиламента, от плюс- к ми­нус-концу, перескакивая с одного мономера на дру­гой. Этот процесс - основа очень многих движений в клетке. Характер этих движений во многом зави­сит от структуры того миозина, который его осуще­ствляет, от того, каковы у этой молекулы головки и хвосты. Например, молекула обычного миозина из поперечнополосатых мышц человека, так называе­мого миозина II, имеет длинный хвост. Переплета­ясь хвостами, эти молекулы образуют миозиновые филаменты с торчащими наружу многими головка­ми (рис. 3). В мышечной клетке очень стабильные актиновые микрофиламенты расположены парал­лельно друг другу на фиксированных расстояниях друг от друга и от миозиновых филаментов, поме­щающихся между ними. Прикрепляясь к актиновым филаментам, головки миозиновых нитей дви­жутся вдоль этих филаментов, и это скольжение - основа всех мышечных движений (см. рис. 3). У других миозинов, например у так называемых ми­озинов I, хвосты очень короткие. Поэтому такие миозины, в отличие от миозинов II, переплетаться хвостами и образовывать филаменты не могут. Вме­сто этого молекулы некоторых миозинов I могут по­одиночке прикрепляться своими короткими хвос­тами к мембранам разных органелл (например, митохондрий, лизосом и др.). Если головка той же молекулы одновременно прикрепится к актиновой нити, то она может двигать органеллу вдоль этой нити (см. рис. 3).

Комбинируя стандартные актиновые микрофи­ламенты с различными миозинами и другими ак­тинсвязывающими белками, клетка строит самые различные структуры, отличающиеся по архитекту­ре и подвижности. Мы уже упоминали об одной из таких структур - миофибрилле, образующейся в высоко специализированных мышечных клетках. Так как в мышце все нити строго параллельны друг другу, то их скольжение и сокращение всей мышцы идет в одном направлении и мышца может развить большое напряжение. У большинства других кле­ток, например в клетках соединительной ткани (фибробластах), клетках эпителия, лейкоцитах и других клетках, большая часть микрофиламентов образует другую структуру - актиновый кортекс, располагающийся под мембраной. Кортекс, подоб­но миофибрилле, может сокращаться за счет взаи­модействия актиновых микрофиламентов с миозиновыми молекулами. Однако, в отличие от миофибриллы, в кортексе микрофиламенты далеко не всегда параллельны друг другу, часто они образу­ют сложные сети. Поэтому сжатие кортекса идет обычно в нескольких направлениях. Кроме того, в кортексе, в отличие от миофибриллы, микрофила­менты очень динамичны; кортекс все время обнов­ляется и перестраивается путем полимеризации-деполимеризации нитей. Если средняя продолжи­тельность жизни микрофиламента в миофибрилле более 7 дней, то в кортексе лейкоцита - всего лишь 5с.

Основным и очень важным типом перестроек кортекса являются псевдоподиальные реакции:

Рис. 3. Взаимодействия актиновых микрофила­ментов (нити из синих кружков) с миозинами (красные структуры).

А - схема движений в миофибрилле мышцы. Мо­лекулы миозина II соединены длинными хвостами в нить, из которой наружу торчат в разные сторо­ны головки. Головки миозиновых молекул движут­ся по двум параллельным актиновым нитям, вы­зывая скольжение этих нитей в двух противопо­ложных направлениях.

Б - схема движения органеллы (зеленый круг) вдоль микрофиламента при помощи миозина I. Молекулы миозина I короткими хвостами при­креплены к мембране органеллы, а концами голо­вок - к актиновой нити.

выбрасывание, прикрепление и сокращение псев­доподий. Рассмотрим подробнее эти реакции. При выбрасывании псевдоподии на поверхности клетки очень быстро, в течение нескольких минут или даже секунд, образуется вырост цитоплазмы. Такой вы­рост может иметь разную форму, например форму плоской пластинки (ламеллоподия), узкого цилин­дра (филоподия) или просто шаровидного пузыря. Внутреннее строение всех типов псевдоподий про­сто: они часто не содержат никаких структур, кроме кортикальных микрофиламентов. При этом в ла-меллоподиях эти микрофиламенты образуют гус­тую уплощенную сеть, а в пузырях - менее упо­рядоченный слой под мембраной (рис. 4). Если микрошприцем инъецировать в клетку раствор мо­номеров актина, помеченных флуоресцирующей краской, а затем наблюдать такую клетку в флуорес­центном микроскопе, где краска ярко светится, то можно видеть, что микрофиламенты из меченых мономеров появляются раньше всего именно в псевдоподиях. Таким образом, псевдоподии явля­ются местом, где из мономеров полимеризуются микрофиламенты. Вероятно, под мембраной в этих местах концентрируются какие-то белки, вызываю­щие полимеризацию новых микрофиламентов, но пока природу этих белков мы еще точно не знаем.

Форма выпячивания может определяться тем, с какими белками свяжутся вновь возникшие микро­филаменты. Это подтверждается недавними опыта­ми Штосселя (Stossel Т. Science, 1993. V. 260. Р. 1086). Он обнаружил, что клетки одной из линий клеток в культуре выпячивают на поверхности лишь шаро­видные пузыри, но не ламеллоподии. Оказалось, что в геноме этих клеток отсутствовал ген, кодиру­ющий белок, который связывает актиновые микро­филаменты в сеть. Специальными методами генной инженерии исследователи ввели в клетки недостаю­щий ген, и тогда клетки стали делать не пузыри, а уп­лощенные ламелоподии. Таким образом, появление в актиновом кортексе одного дополнительного бел­ка направленно изменило архитектуру псевдоподий.

Поверхность конца выброшенной псевдоподии может прикрепиться к подложке, по которой ползет клетка. При этом образуется место прочного кон­такта, где определенные белки мембраны наруж­ным концом молекулы соединяются с белками, прикрепленными к подложке; внутренним концом та же молекула соединяется, через ряд промежуточ­ных звеньев, с актиновыми микрофиламентами псевдоподии.

Сразу после выбрасывания псевдоподия со­держит актин, а миозин II проникает в псевдопо­дию (диффундирует) из внутренней части клетки лишь несколько минут спустя. Взаимодействие ми­озинов с актиновыми нитями вызывает сокращение псевдоподии. Это сокращение может иметь разные последствия для клетки. Если псевдоподия не при­креплена к подложке, она втягивается и исчезает.

Рис. 4. Выросты поверхности клетки, образуе­мые актиновыми микрофиламентами (синие ли­нии).

А -два варианта псевдоподий. /7-пузырь, где под мембраной клетки имеется слой коротких микро­филаментов, не имеющий упорядоченной органи­зации. Л - ламеллоподия - пластинчатый вырост, где микрофиламенты соединены в упорядочен­ную сеть молекулами специального актин-связывающего белка (изогнутые утолщенные линии). Б - стереоцилии на поверхности двух соседних волосковых клеток улитки внутреннего уха. Верти­кальные параллельные актиновые микрофила­менты в каждой стереоцилии связаны друг с дру­гом и с клеточной мембраной молекулами миози­нов и других актинсвязывающих белков (горизонтальные красные линии). В одной клетке разные ряды стереоцилии имеют разную строго фиксированную длину. В соседних клетках стереоцилии соответствующих рядов (среднего и правого) также имеют разную фикси­рованную длину.

Напротив, если псевдоподия, выброшенная на од­ном из краев клетки, успела прочно прикрепиться к подложке, то сокращение ее смещает вперед все те­ло клетки. Повторяя псевдоподиальные реакции, клетка ползет по подложке. Если много псевдопо­дий на разных краях клетки выбрасываются и при­крепляются к подложке одновременно, то они, стремясь сократиться, натягиваются и растягивают клетку в разные стороны, уплощая ее форму. Этот процесс называют распластыванием.

Термин "псевдоподия" означает в переводе - ложная ножка. Это действительно ножка, которая двигает клетку вперед по подложке. Вместе с тем это ножка особая: в отличие от ноги человека псев­доподия может вырасти заново из тела клетки, об­разовать свои мышцы, сократиться и исчезнуть за считанные минуты. Как мы видели, эволюция псевдоподии является результатом серии сложных молекулярных реакций: полимеризации актиновых нитей, присоединения к этим нитям других белков, связывающих их в сети и вызывающих их перемещение, а также связывания нитей с белками мембраны.

Псевдоподии - лишь один из многих типов от­ростков, содержащих актиновые микрофиламенты. Расскажем еще об одном виде весьма важных спе­циализированных отростков, так называемых сте-реоцилиях (см. рис. 4). Эти отростки располагаются пучками на верхней поверхности волосковых кле­ток улитки внутреннего уха, клеток, отвечающих за восприятие звуков. Стереоцилии наполнены от ос­нования до верхушки параллельными друг другу стабильными актиновыми микрофиламентами; между ними и мембраной имеются молекулы дру­гих белков, в том числе специальных миозинов. В каждой клетке все стереоцилии и их микрофила­менты имеют строго определенные размеры; "до­пуск" вариаций такой длины не более 5%. На по­верхности каждой клетки они располагаются подобно трубам органа, рядами "по росту": самые короткие в переднем ряду, а самые длинные - в зад­нем (см. рис. 4). При этом длина и ширина стерео­цилии самого длинного ряда в разных волосковых клетках закономерно меняются от клетки к клетке вдоль поверхности улитки (см. рис. 4). Такая точ­ность размеров стереоцилии очень важна, так как разные клетки улитки активируются звуками раз­ной частоты и амплитуды: низкие звуки восприни­маются клетками на одном конце улитки, высокие - на другом. Полагают, что звуковая волна вызывает колебания стереоцилии, притом на различные час­тоты звука резонируют стереоцилии разной длины и, следовательно, активируются разные клетки.

Мы пока еще не знаем, как в эмбриональном пе­риоде создается замечательная "музыкальная" ар­хитектура стереоцилии; это увлекательная пробле­ма для исследователей. Совсем недавно было сделано еще одно неожиданное открытие. Сущест­вует особая наследственная глухота и слепота, так называемый синдром Ашера; одно из его проявле­ний - дегенерация волосковых клеток уха. Большая группа исследователей (Weil et al. Nature, 1995. V. 374. P. 60.) показала, что основой болезни являет­ся мутация, инактивирующая один из особых мио­зинов, так называемый миозин VIIA. Что именно делает этот миозин в волосковых клетках, как он участвует в реакциях стереоцилии на звук, мы пока не знаем. Еще менее понятно, почему тот же мио­зин необходим для восприятия света клетками сет­чатки глаза, почему без одного этого белка цитоскелета человек становится не только глухим, но и слепым. Мы еще и еще раз убеждаемся, как велико разнообразие конструкций, которые клетка умеет строить на основе одного основного элемента цито-скелета - актиновыхмикрофиламентов.

СИСТЕМА МИКРОТРУБОЧЕК

Микротрубочки представляют цилиндры диа­метром 25 нанометров с полостью внутри. Их стенка образована мономерами тубулина. Микротру­бочки, подобно актиновым микрофиламентам, полярны: полимеризация из мономеров идет легче на плюс-конце, чем на минус-конце. Система мик­ротрубочек, в отличие от актинового кортекса, в большинстве клеток строго централизована: в то время как в кортексе может работать одновременно множество центров полимеризации, из которых растут новые микрофиламенты, микротрубочки ча­сто имеют лишь 1 - 2 центра полимеризации на клетку. Эти центры, организующие микротрубочки (ЦОМТ), хорошо видны не только под электрон­ным, но и под световым микроскопом. Практичес­ки все микротрубочки в клетках растут из этих цен­тров плюс-концами к периферии, и поэтому системы микротрубочек часто имеют вид звезд. На­иболее распространенные варианты ЦОМТ - центросомы, из которых растет митотическое веретено и "звезды" микротрубочек во многих клетках, а также базальные тельца, из которых растут микротрубоч­ки жгутиков и ресничек (рис. 5). Замечательное свойство этих центров, что они способны репроду­цироваться: новый центр вырастает рядом со ста­рым и затем "материнский" и дочерний центры расходятся. Долго искали в центрах ДНК, но не на­шли. Удвоение центров, видимо, имеет совсем осо­бый механизм, отличный от удвоения ДНК, но при­роду его мы еще не знаем.

Как уже говорилось, микротрубочки разных структур сильно различаются по стабильности. Ес­ли инъецировать в клетки раствор тубулина, мечен­ного флуоресцентной краской, то микротрубочки становятся окрашенными, и в флуоресцентный ми­кроскоп можно непосредственно наблюдать, как отдельные микротрубочки быстро растут от центра к периферии, затем быстро укорачиваются, иногда исчезают совсем, опять растут и т.д. (см. рис. 2). Эта смена фаз роста и укорочения - характерная черта систем нестабильных микротрубочек. У многих стабильных микротрубочек, например, в жгутиках сохраняется постоянная длина. Большую или меньшую стабильность придают микротрубочкам особые белки, связывающиеся с их наружной стен­кой и укрепляющие ее.

Некоторые растения образуют специальные яды - вещества, которые избирательно нарушают дина­мику микротрубочек в самых разных типах клеток. Большая группа таких веществ (колхицин, колце-мид, винбластин) деполимеризует нестабильные микротрубочки. Точнее говоря, молекулы этих ве­ществ присоединяются к мономерам тубулина и блокируют рост микротрубочек. При этом их рас­пад продолжается, и через короткое время все мик­ротрубочки исчезают. В частности, у таких клеток в митозе исчезает митотическое веретено и хромосо­мы не могут разойтись к полюсам, поэтому деление клеток не завершается. Естественно, стабильные микротрубочки в жгутиках мало чувствительны к действию этих веществ.

Рис. 5. Структуры, образуемые системой микротрубочек и организующих их центров.

А - параллельные микротрубочки ресничек, растущие от базальных телец к поверхности клетки.

Б - микротрубочки митотического веретена, растущие навстречу друг другу от двух центров, расположенных на

полюсах веретена. Некоторые из микротрубочек прикрепляются плюс-концами к особым участкам (кинетохорам)

хромосом. На схеме две хромосомы в метафазе, то есть до начала расхождения к полюсам.

Из коры тиса было выделено особое вещество, таксол, действие которого на микротрубочки про­тивоположно действию веществ группы колхицина: молекулы таксола, связываясь с микротрубочками, препятствуют их деполимеризации. Все трубочки становятся стабильными и не могут укорачиваться и исчезать. Во время митоза обработанные таксо-лом клетки со сверхустойчивыми микротрубочками не могут разделиться, также как обработанные кол­хицином клетки, у которых нет микротрубочек. Очевидно, для нормальной работы веретена и, ве­роятно, многих других систем микротрубочек суще­ственно не только присутствие трубочек, но и их динамичность, постоянный рост и распад. Вещест­ва, действующие на микротрубочки (винбластин, таксол и другие), широко используются в клинике при химиотерапии некоторых опухолей для оста­новки деления опухолевых клеток.

Среди белков, прикрепленных к микротрубоч­кам, очень важны моторные молекулы - динеины и кинезины (рис. 6). Эти молекулы одним концом прикрепляются сбоку к микротрубочке и могут дви­гаться по ней, если доставлять им энергию в виде АТФ. При этом большинство вариантов кинезина двигается по трубочке к ее плюс-концу, а все динеи­ны - к минус-концу. Другим полюсом молекула ди-неина или кинезина может прикрепиться к мемб­ранным органеллам или к другим микротрубочкам. В результате эти молекулярные моторы могут со­вершать много разных типов движений. В жгутике и ресничке молекулы динеина, прикрепляясь к двум соседним микротрубочкам, заставляют эти микротрубочки скользить относительно друг друга. Так как своими основаниями (минус-концами) ми­кротрубочки закреплены на базальных тельцах, то скольжение соседних микротрубочек ведет к тому, что жгутик изгибается (см. рис. 6). Вызванное мото­рами взаимное скольжение микротрубочек, отходя­щих от разных полюсов митотического веретена, по-видимому, приводит к расхождению этих полю­сов в противоположных направлениях. Соединяясь с органеллами, микротрубочковые моторы могут перемещать эти органеллы в клетке. В зависимости от того, какой мотор работает, направление движе­ния будет разным: кинезин "повезет" органеллу к плюс-концу микротрубочки, то есть к периферии, динеин - к центру клетки. Иначе говоря, органеллы в клетке могут "ездить" по клетке по одним и тем же

Рис. 6. Взаимодействия микротрубочек (цилиндры) с соответствующими моторными молекулами. Р- микротру­бочки реснички.

Молекулы динеина прикреплены хвостами (линии) и головками (черные кружки) к соседним микротрубочкам. Пе­ремещение головок вызывает сгибание обеих микротрубочек. К, Д - движения органелл (большие круги) при по­мощи молекул кинезина (К) или динеина (Д) вдоль микротрубочки в противоположных направлениях.

рельсам-микротрубочкам туда и обратно, пользуясь разными моторами.

Сейчас существуют замечательные микроско­пы, где контрастность изображения сильно увели­чивается с помощью специальных компьютерных программ. Такие приборы позволяют длительно на­блюдать за движениями отдельных органелл в жи­вой клетке. Эти наблюдения показывают, что одна и та же органелла, активно двигаясь, то идет к пери­ферии клетки, то возвращается обратно, нередко меняя направление несколько раз в минуту. Что оп­ределяет такую смену направлений? Одна из воз­можностей, которая сейчас активно проверяется, состоит в том, что на одной и той же органелле си­дят несколько разных молекул-моторов, способных двигать эту органеллу и к центру и от центра. Эти моторы могут включаться и переключаться специ­альными регуляторами, например ферментами, присоединяющими к моторной группе фосфатные группы и отщепляющими эти группы. Кроме мик-ротрубочковых моторов, существуют, как мы уже говорили, еще миозиновые молекулы, способные перевозить органеллы вдоль актиновых микрофиламентов. Каково соотношение между этими двумя видами транспорта в клетке? Недавно предложено красивое сравнение: микротрубочки, идущие на дальние расстояния, подобны скоростным шоссе, по которым органеллы быстро перемещаются меж­ду центром и периферией клетки, тогда как микро-филаменты - местные дороги. Доехав по микротру­бочке до нужной области клетки, органелла может сменить мотор и пересесть на местный микрофиламент, на котором доедет точно до места назначения. Напомним, что и сами рельсы, по которым ездят органеллы, микротрубочки и микрофиламенты, могут быстро менять свою длину и положение в ре­зультате полимеризации-деполимеризации. Таким образом, распределение органелл в клетке в каждый данный момент является статистическим результа­том сочетания активных перемещений этих орга­нелл по цитоскелетным путям и динамики самих этих путей.

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ.

Это третий основной компонент цитоскелета, названный так потому, что его нити по диаметру (8 - 10 нанометров) меньше, чем микротрубочки, но больше, чем микрофиламенты. Эти нити много­численны в цитоплазме большинства клеток; по-видимому, они растут из многих центров, но этот вопрос еще окончательно не решен. Промежуточ­ные филаменты - очень прочные структуры: разны­ми экстрагирующими солевыми растворами можно удалить из клетки все ее компоненты, а сеть проме­жуточных филаментов сохраняется, пока мы не применим сверхсильные денатурирующие агенты, например концентрированный раствор мочевины. Другое отличие этих филаментов от других цитоскелетных нитей: их мономеры легко полимеризуются, но с большим трудом деполимезируются, поэтому в клетке свободных растворенных мономеров почти нет. Впрочем, когда это необходимо, клетка легко перестраивает свою систему межуточных филамен­тов. Например, при митозе все филаменты распада­ются на фрагменты, по-видимому, в результате то­го, что специальный фермент присоединяет к их мономерам фосфатные группы. После митоза фи­ламенты быстро востанавливаются.

Загадкой остается вопрос о том, почему в разных тканях эти морфологически сходные филаменты построены из разных белков (см. выше). Особенно велико разнообразие белков межуточных филамен-тов эпителиальных тканей, кератинов в каждой клетке. Выделено уже более 30 кератинов, комби­нирующихся по два типа в каждой клетке. Разные наборы кератинов имеются в различных типах эпителиев и даже в разных участках одного эпителия. Например, в эпителии кожи, покрывающем ладо­ни и пятки человека, обнаружен особый кератин (№ 9), которого нет в эпителиях других участков ко­жи или каких-либо иных тканей. Не одинаковы по белковому составу и промежуточные филаменты (нейрофибриллы) разных типов нервных клеток.

Вопрос о функциях всех этих филаментов совер­шенно неясен. Наиболее вероятная гипотеза: про­межуточные филаменты укрепляют клетки и ткани механически, делают их более прочными. Вспом­ним, что кожа пятки и ладони испытывает разную нагрузку и, возможно, что молекулярные различия кератинов делают филаменты лучше приспособ­ленными к разным нагрузкам.

Сильным аргументом в пользу механической роли промежуточных филаментов являются новые данные о том, что основой некоторых наследствен­ных кожных болезней, при которых резко снижает­ся прочность кожного эпителия, являются мутации генов определенных кератинов. В частности, при мутациях упомянутого выше кератина № 9, специ­фичного для пятки и ладони, нарушается прочность кожи именно в этих участках. Однако многие дру­гие попытки выяснить роль промежуточных фила­ментов дали обескураживающие результаты. На­пример, недавно группа исследователей методами генной инженерии получила линию мышей, у кото­рых из генома был удален ген виментина, белка, из которого сделаны промежуточные филаменты во всех клетках костей, хряща, соединительной ткани, клеток крови и костного мозга. Такие "безвиментиновые" мыши развивались совершенно нормально, и разнообразные пробы на строение и функции раз­ных тканей не обнаружили у них никаких дефектов. Зачем же в столь многих клетках существуют много­численные виментиновые филаменты? Вероятно, они играют какую-то важную роль, но мы сегодня еще не придумали эксперимент, который выявил бы эту роль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

ЦИТОСКЕЛЕТ - БОЛЬШЕ, ЧЕМ СКЕЛЕТ.

Кто первый употребил термин "цитоскелет"? Еще в начале века русский биолог Н.К. Кольцов на основании большой серии опытов по изучению свойств жгутиков сперматозоидов пришел к выводу о том, что в клетке есть скелетные структуры. Одна­ко термин "цитоскелет" распространился широко лишь в последние два десятилетия. Первоначально предполагалось, что цитоскелетные нити являются опорным каркасом клетки, ее скелетом. Цитоскелет несомненно выполняет эту роль, но это лишь одна из многих функций этих структур в клетке.

Как мы видели, цитоскелет, особенно актиновый, является двигательным аппаратом клеток, а также аппаратом органелл, в чем-то аналогичным системе кровообращения многоклеточного орга­низма. Данные о стереоцилиях иллюстрируют роль цитоскелета в восприятии клеткой сигналов из внешнего мира. В следующей статье мы разберем эксперименты, свидетельствующие о том, что цито­скелет, наряду с клеточной мембраной, играет клю­чевую роль в обобщении и запоминании результа­тов реакций на внешние воздействия и в определении поведения клетки. Эту функцию мож­но сравнить с деятельностью мозга. Все эти много­образные функции цитоскелет выполняет, совер­шая реорганизации двух типов: а) полимеризацию и деполимеризацию цитоскелетных нитей и б) совер­шаемые с помощью молекулярных моторов движе­ния одних нитей относительно других и нитей отно­сительно органелл. Эти реорганизации, имеющие бесконечное число вариантов, являются основой уникальной подвижной архитектуры клетки, в ко­торой стабильность удивительно сочетается с дина­мичностью.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ченцов Ю.С. Общая цитология (Введение в биоло­гию клетки ). 3-е изд. М.: Изд-во МГУ, 1995.

2. Альберте А., Брей Д., Льюис Р. и др. Молекулярная биология клетки. В 3 т. Пер. с англ. М.: Мир, 1994.

Юрий Маркович Васильев, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, про­фессор кафедры вирусологии МГУ, зав. лаборато­рией Всероссийского онкологического научного центра. Автор 180 научных работ, включая 6 моно­графий на русском и английском языках.

КЛЕТКА КАК АРХИТЕКТУРНОЕ ЧУДО.

II. Цитоскелет, способный чувствовать и помнить.

Ю. М. ВАСИЛЬЕВ

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

В статье рассмотрены механизмы клеточных движений и в особенности механизмы ориентировки образования псевдоподий внешними сигналами, а также роль двух цитоскелетных систем, актиновых микрофиламентов и микротрубочек, в стабилизации ориентировки и поддержании направления движений. Показана определяющая роль таких механизмов в организации клеток и тканей многоклеточного организма.

ВВЕДЕНИЕ. МОЛЕКУЛЫ И МОРФОЛОГИЯ

Изучение молекулярных механизмов морфогенеза - одна из основных, может быть, главная проблема биологии ближайшего будущего. Мы уже много знаем о генетических механизмах, определяющих природу химических компонентов клетки, и в особенности структуру белков. Вместе с тем, мы еще плохо понимаем, как особенности этих химических компонентов определяют сложнейшую структуру всего многоклеточного организма. Мы не знаем, как изменения генов и кодируемых ими белков реализуются в изменениях формы и размещения клеток, тканей и органов. Приведу только один наглядный пример: мы хорошо понимаем, как ДНК родителей определяет структуру любого белка их ребенка, но совершенно ничего не знаем о том, как эта ДНК определяет морфологические черты лица их ребенка, то есть форму его подбородка, губ, носа, ушей и т.д. А ведь о сходстве детей с родителями мы обычно судим именно по этим чертам.

Одним из наиболее перспективных подходов к этой проблеме является исследование механизмов изменений цитоскелета. В предыдущей статье1 я рассказал о том, что цитоскелет - это основа подвижной архитектуры клеток животных и растений. Напомню, что цитоскелет образован тремя системами белковых нитей: микрофиламентами, состоящими из белка актина, микротрубочками, состоящими из белка тубулина и промежуточными филаментами, состоящими из разных белков. Эти нити собираются (полимеризуются) из соответствующих белковых молекул и вновь разбираются на отдельные молекулы. Благодаря такой полимеризации-деполимеризации цитоскелет непрерывно перестраивается, и эти перестройки являются основой изменений формы и движений клеток, лежащих в основе образования клеток и органов.

В этой статье мы разберем некоторые простейшие цитоскелетные механизмы таких движений и изменений формы. Конкретнее говоря, попытаюсь объяснить, как клетка (или часть ее) ползет по твердой поверхности (так называемой подложке) и при том ползет в определенном направлении, проявляя зачастую поразительную способность выбирать определенную ориентировку и, когда надо, соблюдать эту ориентировку, а когда надо - менять ее. На примере двух разных клеточных типов фибробластов и нейронов попытаюсь показать, как разумные движения отдельных клеток приводят к образованию сложных многоклеточных структур.

ФИБРОБЛАСТЫ ПОЛЗУТ К ЦЕЛИ

Все клетки ползут, образуя на переднем крае динамичные выросты - псевдоподии разной формы. В псевдоподиях под мембраной клетки полимеризу-ются актиновые микрофиламенты, которые связываются с миозином и другими белками (см. предыдущую статью). Псевдоподии могут прикрепляться к поверхности подложки и, сокращаясь, тянут всю клетку вперед. Таков основной механизм движения. Очевидно, направление движения определяется тем, на каком краю клетки будут образовываться, прикрепляться и сокращаться псевдоподии.

Что же определяет места образования псевдоподий? Для того чтобы лучше это понять, рассмотрим движения одной из клеток, чаще всего используемых в экспериментах, клеток соединительной ткани - фибробластов. Фибробласты, помещенные в культуру и распластавшиеся на плоской подложке, например, на дне чашки Петри со средой, приобретают форму веера или веретена. Они поляризованы, то есть образуют псевдоподии лишь на одном или двух полюсах. Эти клетки могут ползти направленно в сторону одного из активных полюсов. Их боковые края неактивны.

Благодаря динамике цитоскелета фибробласт может менять форму и направление движений в ответ на изменения окружающего внешнего мира: например, в ответ на изменения питательной среды и поверхности подложки. Ориентировка этих клеток начинается с того, что клетка получает направленный сигнал из внешнего мира. Например, поместим возле одного из краев клетки капилляр и будем из него выпускать в среду раствор веществ, который, попадая на поверхность клетки, вызывает в этом месте поверхности образование псевдоподий; в результате клетка начинает направленно двигаться в сторону сигнала. Это явление называется положительным химиотаксисом. Веществами, вызывающими такой химиотаксис у фибробластов, являются некоторые специальные белки, так называемые факторы роста. Химиотаксические вещества связываются со специальными белками - рецепторами в наружной мембране клетки и активизируют их. Такая активация через какие-то еще неясные промежуточные химические реакции вызывает полимеризацию актина под соответствующим местом мембраны и выпячивание псевдоподии. Если кон центрация активирующих веществ с разных сторон клетки различна, то на одном конце клетки будет образовываться и прикрепляться к подложке больше псевдоподий, чем на другом. Контакт с другой клеткой может действовать противоположно хи-миотаксису: если какой-то участок активного края фибробласта касается поверхности другой клетки, то образование псевдоподий в этом месте края немедленно прекращается; происходит "контактное торможение" или "контактный паралич" этого участка (рис. 1).

Рис. 1. Контактный паралич мышиного фибробласта при встрече с другой клеткой. В кадрах микросъемки обведены контуры клеток. Время между последовательными кадрами составляет 20 мин. а - фибробласт, ползущий направо: широкие псевдоподии на правом полюсе; б - правый активный полюс вступил в контакт с краем другой клетки; в - г - образование псевдоподий вдоль контакта почти прекратилось. Клетка сменила места образования псевдоподий, вытягивается и движется параллельно краю другой клетки.

Механизмы такого паралича еще неясны, но его биологический смысл очевиден: благодаря параличу клетка не заползает на другую клетку, но, коснувшись ее, поворачивает туда, где есть свободная поверхность подложки. Двигаясь, клетки соблюдают взаимную вежливость. Третий внешний фактор, меняющий распределение псевдоподий - различная адгезивность ("липкость") разных участков поверхности подложки. Например, посадим клетку не на широкое плоское стекло, а на узкий стеклянный цилиндр, диаметр которого (30 микрометров) лишь немногим больше диаметра самой клетки. Тогда фибробласт начинает выбрасывать псевдоподии во все стороны. Но лишь те псевдоподии, которые выброшены вдоль, а не поперек цилиндра, смогут коснуться свободной поверхности стекла и прикрепиться к ней; псевдоподии, выброшенные поперек стекла, такой подложки не найдут, и клетка втянет их обратно (рис. 2, 3).

Таким образом, во всех случаях под влиянием внешних факторов у клетки возникает первичная поляризация образования и прикрепления псевдоподий. Однако такая поляризация часто очень неустойчива. Чтобы направленно двигаться, клетка должна запомнить и стабилизировать эффект внешних факторов. Эта стабилизация выражается в том, что клетка совсем перестает выбрасывать псевдоподии в тех направлениях, где их прикрепление было менее удачно, и начинает их выбрасывать более эффективно только в наиболее удачных направлениях, например, вдоль цилиндра или ближе к источнику химиотаксического вещества (рис. За).

Такая стабильная поляризация достигается благодаря перестройкам архитектуры двух цитоскелет-ных систем - актина и микротрубочек. Первой ее стадией является реорганизация актинового кортек-са, то есть сети микрофиламентов, расположенной под мембраной всего тела клетки. Как мы знаем, прикрепленные псевдоподии содержат актиновые микрофиламенты, соединенные одним концом с подложкой через мембрану, а другим концом с мик-рофиламентами в кортексе тела клетки. Там, где прикрепления к подложке прочны, микрофиламенты, пытаясь сократиться, будуттянуть в свою сторону весь кортекс. В тех местах, где прикрепленных псевдоподий больше, натяжение сильнее, и кортекс будет вытягиваться вдоль этого направления натяжений. При этом актиновые микрофиламенты в кортексе будут, натягиваясь, ориентироваться вдоль этого направления. Каким-то неизвестным еще образом ориентировка кортекса определяет места выбрасывания новых псевдоподий: клетка перестает их выбрасывать на тех боковых краях, которые параллельны натяжениям. Эта роль натяжения подтверждена прямыми опытами: если один из участков поверхности клетки растянуть механически микроиглой, то образование псевдоподий в таком участке прекращается. Стабилизация натяжением резко усиливает небольшие количественные различия в числе прикрепленных псевдоподий в разных участках поверхности: происходит качественное разделение поверхности на стабильные и активные участки. У фибробластов для стабилизации формы, кроме актинового кортекса, необходима еще и вторая цитоскелетная система, микротрубочки. Если разрушить микротрубочки колхицином или похожим веществом (см. предыдущую статью), то фибробласт теряет вытянутую форму, а его актиновые микрофиламенты в кортексе теряют общую ориентировку. Сосредоточить свои псевдоподии на одном участке края такая клетка не может, даже если имеется ориентирующий внешний фактор, например, цилиндрическая подложка или химиотаксический градиент (рис. 36). Клетка без микротрубочек все время выбрасывает псевдоподии по всему краю во всех возможных направлениях. Разумеется, такая клетка теряет способность направленно двигаться, но совершает лишь бессмысленный "бег на месте".

Рис. 2. Фибробласт, начавший вытягиваться на цилиндрической подложке. Псевдоподии прикрепляются вдоль оси подложки, но не поперек ее. Сканирующий электронный микроскоп.

Рис. 3. Движения фибробласта, посаженного на узкую плоскую полоску стекла (параллельные линии). Сверху вниз контуры одной клетки, сделанные по последовательным кадрам киносъемки; цифры рядом со стрелками -время между кадрами, а - контроль. Клетка постепенно вытягивается вдоль полоски. Образование псевдоподий сосредоточивается на полюсах и прекращается на боковых краях клетки, параллельных длине полоски (стабилизация боковых краев); б - клетка в среде с колцемидом, разрушившим микротрубочки. Клетка несколько вытянулась, но полной стабилизации боковых краев не происходит: псевдоподии образуются и вдоль и поперек длины полоски.

Таким образом, у фибробластов имеется две степени цитоскелетной стабилизации формы и движений - актиновая и микротрубочковая. В отличие от фибробластов, у некоторых клеток, слабо вытянутых, например, у лейкоцитов, разрушение микротрубочек почти не меняет форму и движения; очевидно, у таких клеток "работает" одна актиновая стабилизация. Лейкоцит меняет ориентировку и направление движений гораздо чаще, чем фиброб-ласт. Можно сравнить актиновую стабилизацию с кратковременной памятью, которая запоминает эффекты сигналов лишь на небольшое время, а ми-кротрубочковую стабилизацию фибробласта - с долговременной памятью. Остается нерешенным еще вопрос о механизмах стабилизации: каким образом реорганизация цитоскелета определяет места выбрасывания псевдоподий? Вероятнее всего, ак-тиновые нити и микротрубочки транспортируют на периферию, к определенным клеткам какие-то ор-ганеллы, индуцирующие в этих местах полимеризацию новых микрофиламентов и, следовательно, выбрасывание псевдоподий. Действительно, стабилизацию мест образования псевдоподий можно нарушить у фибробластов агентами, нарушающими транспорт органелл, в особенности инъекцией антител к кинезину - известному нам мотору, везущему органеллы к микротрубочкам. Какие именно орга-неллы регулируют образование псевдоподий, остается пока неясным.

Движения фибробластов, как и движения других клеток, удобнее изучать в культуре, чем в организме, хотя бы потому, что только в культуре и подложка (дно чашки Петри), и среда прозрачны, и все детали движений можно наблюдать под микроскопом. Вместе с тем, закономерности, открытые в культуре, имеют общий характер и относятся и к движениям клеток в организме. Выберем только один пример - заживление раны: кожа ранена каким-то орудием, из поврежденных сосудов выходит кровь, которая свертывается в ране. При свертывании крови образуется сгусток фибриновых нитей, и из разрушающихся клеток крови - тромбоцитов выделяется тромбоцитарный фактор роста. По всей вероятности, градиент этого фактора в среде привлекает в рану фибробласты из окружающей соединительной ткани. Нити фибрина, подобно цилиндрическим подложкам в культуре, могут служить "рельсами", направляющими дополнительно движение фиброблаастов в рану. Наконец, клетки, идущие в рану с разных сторон, благодаря контактному параличу, ориентируются упорядоченно друг относительно друга. Фибробласты, направленно мигрировавшие в рану, начинают там размножаться и делать коллагеновые волокна. Образуется рубец, и рана заживает. Заживление раны - лишь один из вариантов процессов, при которых направленные миграции фибробластов и близких к ним клеток, например, костных клеток, остеобластов или хрящевых клеток, хондробластов, восстанавливают поврежденную структуру соответствующих тканей нашего организма или меняют эту структуру в ответ на действие внешних факторов.

ОТРОСТОК НЕЙРОНА ПОЛЗЕТ К ЦЕЛИ

Рассмотрим теперь движения клеток, которые составляют основу самой сложной из существующих в природе организаций - нашего мозга, нашей нервной системы. Особая, наверное, главная черта этой организации - система сложнейших индивидуальных связей между клетками, по которым через особые межклеточные контакты, синапсы, сигнал передается от одной нервной клетки (нейрона) к другому нейрону или мышечной клетке. Для такого направленного проведения сигналов нейроны в процессе эмбрионального развития образуют отростки, которые растут к клетке-мишени. Иногда длина таких отростков может быть очень большой: отростки нейронов коры головного мозга, соединяющиеся с двигательными нейронами спинного мозга, у человека могут превышать 1 м. Рост отростков очень точно направлен: они соединяются только с нужными клетками-мишенями, то есть с определенной группой нейронов или определенной мышцей. Важность такой точности соединений для правильной работы мозга очевидна: например, как бы мы двигали рукой, если бы отростки двигательных нейронов, заведующих движениями мизинца, соединялись не с мышцами мизинца, а с мышцами большого пальца или наоборот?

Как же осуществляется такой точно ориентированный рост отростков нейронов? Разберем кратко, как происходит такая ориентировка у эмбриональных нервных клеток, помещенных в культуру. Рост отростков нервных клеток внешне совершенно отличен от движений фибробластов: у нейрона ползет по подложке лишь маленький уплощенный фрагмент клетки - так называемый конус роста и прикрепляющий на переднем крае псевдоподии (рис. 4). Конус роста очень похож на уменьшенную копию безъядерного фибробласта. Задний конец конуса роста соединен с телом клетки цилиндрическим стволом, богатым микротрубочками. Ни ствол, ни тело клетки псевдоподий не образуют. Двигаясь вперед, конус роста тянет за собой ствол, который при этом удлиняется. Иногда сравнивают тело нейрона с хозяином, который на удлиняющемся поводке (стволе) держит бегущую собачку (конус роста).

Направление движения конуса роста определяется внешними сигналами, меняющими образование и прикрепление псевдоподий: а) градиентами концентрации специальных белков, растворенных в среде (так называемого фактора роста нервов) и б) формой подложки: в частности, конус роста хорошо ползет вдоль разных цилиндрических поверхностей. Например, одним из факторов стабилизации эффекта внешних агентов является натяжение кортекса: микроигла, натягивающая отросток в сторону, может соответственно изменить направление его роста. Для ориентировки отростка необходима и система микротрубочек: при разрушении этой системы рост отростка прекращается, и сам отросток сокращается. Таким образом, несмотря на внешние различия, механизмы движений фибробластов и роста нервных отростков сходны по общим механизмам: они включают создание внешними факторами неравномерности прикрепления и стабилизацию этих различий двумя цитоскелетными системами.

Особенность нейронов заключается в чрезвычайно длительной и стойкой микротрубочковой стабилизации отростков, в длительной "долговременной памяти". Приобретя определенную ориентировку, отростки сохраняют ее неопределенно долго, часто до конца жизни организма. Именно такая модификация цитоскелетного механизма стабилизации отростков обеспечивает правильную организацию нервной системы.

Рис. 4. Контуры отростка нейрона, растущего вправо. Справа - конус роста, слева - ствол отростка, тело нейрона - на левом конце ствола вне рисунка. Время между кадрами а и б - 5 мин. За это время на активном краю конуса роста вытянулось и сократилось несколько псевдоподий, тогда как контур стабильного края ствола не изменился. На стекле вне клетки - неподвижные точки; видно, как сдвинулся вправо конус роста за время между кадрами.

ЛОЖНЫЕ ВНУТРЕННИЕ СИГНАЛЫ АКТИВИРУЮТ НЕРЕГУЛИРУЕМЫЕ ДВИЖЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Нормальная система регуляции движений нормальных клеток может портиться в результате мутаций, и эта порча может иметь самые серьезные последствия для всего организма. Как мы видели, движения нормальных клеток, таких как фибробла-сты, вызываются и регулируются внешними сигналами, например, факторами роста, выделяемыми другими клетками, такими как тромбоциты. Эти приходящие извне молекулы активируют рецепторы мембраны фибробласта и через ряд промежуточных стадий реакций вызывают образование псевдоподий. В некоторых клетках могут произойти мутации генов, кодирующих белки, участвующие в такой системе проведения сигналов. В результате синтезируются белки, постоянно активирующие клетку, независимо от внешних сигналов. Например, нормальный фибробласт не синтезирует тром-боцитарный фактор роста; ген, кодирующий этот белок, "молчит" в нормальном фибробласте. Однако, если этот ген мутирует и активируется, то фибробласт начинает синтезировать и выделять такой фактор. Сев на рецепторы мембраны, этот белок будет стимулировать ту же клетку, которая его выработала: эта клетка начнет двигаться независимо от внешних сигналов, активируя саму себя (рис. 5).

Рис. 5. Вверху - нормальный фибробласт движется по направлению к внешнему сигналу - градиенту тромбоцитарного фактора роста ДФР/, выделяемого на расстоянии тромбоцитами. Внизу - опухолевый фибробласт, движущийся беспорядочно под влиянием ТФР, выделяемого им самим. Это один из многих вариантов стимуляции опухолевой клетки собственными "внутренними" сигналами.

Сейчас мы знаем, что опухолевые клетки - это клетки с мутациями генов, ответственных за проведение сигналов. "Самостимуляция" клеточных движений в результате некоторых из таких мутаций, по-видимому, является основой самых опасных для организма свойств некоторых опухолевых клеток: их способности к инвазии и метастазированию, то есть способности выйти из той ткани, где возникли, и двигаться в другие ткани и даже в другие органы, давая там начало новым колониям, разрушающим нормальные структуры организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. КЛЕТКА ПРОБУЕТ, ОЦЕНИВАЕТ, ЗАПОМИНАЕТ

Подведем теперь некоторые итоги. Выбрасывая псевдоподии в ответ на внешние сигналы, клетка пробует и оценивает свое окружение. Где можно лучше прикрепить эти псевдоподии? Куда можно и нужно ползти? Неравномерное образование, прикрепление и натяжение псевдоподий в разных участках поверхности клетки вызывает перестройку всего цитоскелета, сперва актинового, потом микротрубочкового. Реорганизуя цитоскелет, клетки запоминают результаты предыдущих проб, предыдущих псевдоподиальных реакций и стабилизируют направления будущих реакций.

Таким образом, клетка все время исследует окружающий ее мир и меняет свое поведение в зависимости от результатов этого исследования. Один и тот же механизм в разных его модификациях обеспечивает и движение фибробластов при заживлении раны, и движения отростков нейронов при образовании нервной системы и, вероятно, множество других процессов морфогенеза, приводящих к формированию нашего многоклеточного организма. При этом поведение каждой отдельной клетки социально разумно: оно согласовано с поведением окружающих ее клеток через сигналы, поступающие от клетки к клетке через жидкую среду или прямой клеточный контакт. Каждый тип клеток реагирует на сигналы по-своему. Эти различия определяются химическими различиями белковых молекул реагирующих систем, например, рецепторов, цитоскеле-та и т.д. Разумеется, эти различия определяются особенностями кодирующих белки генов. Порча механизмов оценки социального окружения отдельных клеток приводит к тому, что эти клетки перестают разумно реагировать на внешние сигналы, но активируют сами себя. Такая злокачественная трансформация клеток может вызывать гибель всего организма. Мы не знаем еще точной природы всех нормальных и патологических вариантов этих механизмов морфогенеза, но можно надеяться, что мы уже начали понимать, где искать их единые принципы.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ченцов Ю.С. Общая цитология (Введение в биологию клетки). М.: Изд-во МГУ, 1995. 3-е изд.

2. Албертс А., Брей Д., Льюис Р., Рафф М., Роберте К., УотсонДж. Молекулярная биология клетки в 3 т. пер. с англ. М.: Мир, 1994.

Юрий Маркович Васильев, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, профессор кафедры вирусологии МГУ, зав. лабораторией Всероссийского онкологического научного центра. Автор 180 научных работ, включая 6 монографий на русском и английском языках.

КЛЕТКА.

КАК АРХИТЕКТУРНОЕ ЧУДО.

Часть 3. Клетка единая, но делимая.

Ю. М. ВАСИЛЬЕВ.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

THE CELL AS MIRACLE OF ARCHITECTURE Part 3. Unity and divisibility of cell

Yu. M. VASIL'EV

The ability of cytoplasm for self-organization, that is, for restoration of distribution of its components after distortions of its structure and two alternative types of such distortions: separation of cyto-plasmic fragments from the whole cell or fusion of several mononuclear cells into a multinuclear cell are considered. Possible mechanisms of self-organization of cytoplasms based on the restructuring of cytoskeletal structures are shown.

Рассмотрены способность цитоплазмы к самоорганизации, то есть к восстановлению распределения клеточных компонентов после нарушений структуры двух типов: выделения безъядерных цитоплазматических фрагментов и слияния нескольких одноядерных клеток в одну многоядерную гигантскую клетку. Обсуждаются возможные механизмы такой самоорганизации, основанные на перестройках цитоскелетных структур.

В предыдущих статьях [1, 2] я рассказал о цитоскелете и о трех системах динамичных волокон (актиновыхмикрофиламентах, микротрубочках и промежуточных филаментах), ответственных за форму клетки и ее движения. Темой этой статьи является еще одно замечательное свойство цитоплазмы клетки, также зависящее от цитоскелета, - способность отделенных от клетки фрагментов цитоплазмы самоорганизоваться, то есть восстанавливать взаимное расположение своих структур, подобное тому, которое было характерно для целой клетки.

Общеизвестно, что каждая клетка содержит сложный набор структур, например: покрытые мембранами "пузырьковые" органеллы (митохондрии, цистерны эндоплазматического ретикулума, лизосомы, жировые гранулы, секреторные гранулы, пигментные гранулы у специализированных пигментных клеток и т.д.), рибосомы, центросомы и, наконец, ядро. Ни одна из этих структур не располагается в клетке где попало. Напротив, все время поддерживается правильное взаимное расположение этих структур. Особенно легко наблюдать за таким взаимным расположением структур в культуре, где каждая тканевая клетка, например фибробласт или эпителиоцит, приобретает форму уплощенной пластинки, прикрепленной к плоскому прозрачному дну культуры, так называемой подложке - стеклу или пластику. Поэтому за живыми клетками и их крупными органеллами в такой культуре легко наблюдать при помощи микроскопа, соединенного с видеокамерой. У таких культуральных клеток ядро обычно располагается приблизительно в центре, а рядом с ним образуется зона так называемой эндоплазмы, где скапливается большинство пузырьковых органелл. Здесь же чаще всего располагаются центросомы, от которых радиально расходятся к наружным краям клетки микротрубочки (рис. 1).

Кнаружи от эндоплазмы располагается тонкая пластинка цитоплазмы (ламелла), где пузырьковые органеллы встречаются редко. Основные компоненты ламеллы - это видимые лишь при специальных окрасках элементы цитоскелета: упомянутые уже микротрубочки и располагающийся под мембраной кортикальный слой микрофиламентов [1]. Вблизи наружных краев ламеллы на нижней поверхности клетки располагаются фокальные адгезии - сложные, построенные из нескольких белков бляшки, прикрепляющие клетку к поверхности подложки [3]. У движущихся клеток при видеосъемке на некоторых участках края ламеллы непрерывно образуются выросты - псевдоподии, прикрепляющиеся к подложке и сокращающиеся, при помощи таких псевдоподий клетки ползают по подложке [2].

Рис. 1. Схема опыта с микрохирургическим выделением безъядерного фрагмента цитоплазмы (прямоугольник) из целой клетки. В таком фрагменте восстанавливаются радиальная система микротрубочек (зеленые линии) и центральное расположение органелл (малые кружки)

КЛЕТОЧНЫЕ ФРАГМЕНТЫ САМООРГАНИЗУЮТСЯ В МИНИ-КЛЕТКИ.

Упорядоченное взаимное расположение клеточных структур создается и поддерживается самой живой цитоплазмой, способностью этой цитоплазмы к самоорганизации. Действительно, даже малые фрагменты цитоплазмы, отделенные от остальной клетки, способны восстанавливать подобное взаимное расположение сохранившихся структур. Отрежем от периферии культуральной клетки под микроскопом микроножом небольшой кусочек цитоплазмы, составляющий лишь 3-5% клеточной массы. Через короткое время такой безъядерный фрагмент самоорганизуется: в центральной его части скапливаются пузырьковые органеллы, образуя эндоплазму, а на периферии формируются тонкие ламеллы, прикрепленные по краям к подложке фокальными адгезиями (рис. 1). По краю ламеллы часто возникают псевдоподии, и при их помощи фрагмент может ползать по подложке. Старый центр организации микротрубочек - центросома обычно не попадает во фрагмент, и сохранившиеся в нем периферические куски микротрубочек расположены вначале почти параллельно друг другу, однако вскоре эти микротрубочки реорганизуются в единую радиальную систему, у них возникает подобие центра, из которого микротрубочки расходятся во все стороны к краям фрагмента. Разумеется, такие фрагменты в отличие от целых клеток погибают обычно через 1-2 суток: ведь у них нет ядра и потому невозможен синтез новых информационных РНК, следовательно, быстро тормозится синтез белков, необходимых для роста и просто замещения разрушающихся со временем белковых молекул. Тем не менее способность фрагментов к самоорганизации в мини-клетки и движениям в течение отведенного им короткого срока жизни замечательна.

МНОГОЯДЕРНЫЕ КЛЕТКИ-ГИГАНТЫ ТОЖЕ САМООРГАНИЗУЮТСЯ.

Фантазия Дж. Свифта создала лилипутов - людей, нормально организованных несмотря на миниатюрные размеры. Ясно, что затем почти неизбежно должен был появиться рассказ о великанах, нормально организованных несмотря на резко увеличенные размеры. Сходным образом логика требует, чтобы за рассказом о самоорганизации клеточных фрагментов следовал рассказ о противоположных системах - гигантских клетках, размеры которых резко превышают нормальные.

Действительно, такие клетки существуют и самоорганизуются. Многоядерные гиганты в культуре можно получить двумя способами. Первый способ - слить несколько обычных одноядерных клеток в одну (рис. 2), применив специальные агенты, например полиэтиленгликоль или белки некоторых вирусов. Эти агенты способны превратить две контактирующие друг с другом мембраны соседних клеток в одну. В результате таких повторных слияний получается большая многоядерная клетка. Механизмы подобного слияния мембран довольно сложны, и мы их рассматривать не будем. Второй способ получения гигантов - блокада цитокинеза, последней стадии клеточного деления: разделения цитоплазмы двух дочерних клеток после расхождения хромосом. Как известно, цитокинез - результат образования под мембраной клетки между двумя дочерними ядрами сократимого кольца из актино-вых микрофиламентов и миозиновых молекул, такое кольцо постепенно сжимается, разделяя две клетки. Функцию сократимого кольца и разделение клеток можно блокировать цитохалазином - веществом, специфически нарушающим формирование микрофиламентов. Цитохалазин нарушает только цитокинез, но не предшествующие стадии деления, поэтому в среде с цитохалазином клетка становится двуядерной. Если блокирование цитохалазином повторять в нескольких циклах деления, то можно получить клетки с 4, 8 и большим числом ядер.

Гигантские клетки, полученные обоими способами, могут жить в культуре долго - многие дни и недели. Для нас важно то, что уже вскоре после образования клетки реорганизуются в единую структуру. Чаще всего такие клетки имеют дисковидную форму, но иногда могут вытягиваться и двигаться. Их ядра обычно собираются в единую группу, занимающую центр клетки, а вокруг них скапливаются везикулярные органеллы, образующие эндоплазму. Вокруг эндоплазмы располагается тонкая ламелла. Как и в одноядерных клетках, на краю гигантов постоянно образуются и сокращаются псевдоподии, а на нижней поверхности ламеллы вблизи края формируются фокальные адгезии, прикрепляющие клетку к дну культуры.

Таким образом, в двух различных системах, в небольших фрагментах, отделенных от клетки, и многоядерных гигантах, полученных слиянием нескольких клеток или блокадой их деления, цитоплазма способна самоорганизоваться в структуру, принципиально сходную со структурой нормальной клетки.

Рис. 2. Схема опыта со слиянием нескольких одноядерных клеток. В образовавшейся многоядерной клетке ядра и органеллы собираются в единой центральной части, а несколько систем микротрубочек реорганизуются в единую радиальную систему

МЕХАНИЗМЫ САМООРГАНИЗАЦИИ ЦИТОПЛАЗМЫ СВЯЗАНЫ С ЦИТОСКЕЛЕТОМ.

Каковы механизмы удивительной способности клеточной цитоплазмы к самоорганизации? Точно ответить на этот вопрос мы пока не можем, но некоторые соображения могут быть высказаны. Самоорганизация происходит даже в безъядерных клеточных фрагментах, следовательно, ядро для нее не нужно. Как мы видели, важнейшей частью самоорганизации являются перемещения цитоплазматических органелл, образующих эндоплазму в центральной части фрагмента или гиганта, туда же в гигантских клетках перемещаются и ядра. Естественно предположить, что за эти движения ответственны те же структуры, что и за все другие движения в клетке: фибриллы цитоскелета с прикрепленными к ним и органеллам моторными молекулами [1].

Один из конкретных механизмов такого рода связан с микротрубочками. Напомню еще раз, что в целой клетке микротрубочки растут радиально из центросомы, расположенной около ядра, при этом каждая микротрубочка имеет два конца: центральный минус-конец и периферический плюс-конец. Хотя в отрезанном фрагменте центра нет, микротрубочки в нем перераспределяются, образуя радиальную систему с плюс-концами в центре фрагмента и минус-концами на периферии (рис. 1). Механизм этого перераспределения был недавно проанализирован Родионовым и Бориси [4]. Эти исследователи приготовили фрагменты из пигментных клеток (меланоцитов) кожи черных аквариумных рыбок. Дело в том, что эти клетки содержат в цитоплазме множество черных пигментных гранул, за движениями которых легко наблюдать в культуре. Во фрагментах цитоплазмы таких клеток пигментные гранулы при самоорганизации скапливались в центре, а микротрубочки расходились радиально из центра на периферию. В нормальной клетке различные органеллы, в том числе пигментные гранулы, двигаются при помощи специальных связанных с микротрубочками моторных молекул, динеинов и кинезинов [1]. При этом динеины двигают органеллы к минус-концу микротрубочки, а кинезины - к плюс-концу. Оказалось, что, применив специальный ингибитор, угнетающий действие динеина, можно подавить самоорганизацию микротрубочек и гранул во фрагменте. Ингибиторы кинезинов оказались неэффективными. Таким образом, перемещение гранул и минус-концов микротрубочек в центр фрагмента оказалось результатом их перемещений, осуществляемых при помощи динеина (рис. 3). Эта работа Родионова и Бориси доказала реальное существование по крайней мере одного зависимого от цитоскелета механизма самоорганизации. Однако известно, что элементы самоорганизации во фрагментах могут сохраняться даже после деполимеризации микротрубочек. Поэтому весьма вероятно, что существуют и другие механизмы, зависимые от других цитоскелетных структур - микрофиламентов.

Рис. 3. Упрощенная схема возможного механизма самоорганизации микротрубочек и органелл во фрагменте цитоплазмы, основанная изданных Родионова и Бориси [4]. Слева - две микротрубочки, соединенные с разными участками одной органеллы (кружок). Предполагается, что присоединение осуществляется через посредство специального белка - динеина, способного двигать органеллы вдоль микротрубочек от плюс-конца к минус-концу. Справа - вызываемые динеином взаимные перемещения микротрубочек и органеллы привели к тому, что эта органелла образовала подобие центра, от которого отходят в противоположные стороны две микротрубочки, ориентированные плюс-концами к периферии

Под наружной мембраной каждой клетки расположен сократимый кортикальный слой актиновых микрофиламентов, у клеток, прикрепленных к дну культуры, этот слой растянут. Можно сравнить кор-текс с растянутой резиновой лентой, стремящейся сократиться к своему центру. Очевидно, если разрезать эту ленту на фрагменты, то каждый из фрагментов будет сокращаться к своему новому центру. Наоборот, если несколько кусков ленты склеить друг с другом, то объединенная лента будет сокращаться по направлению к новому единому центру. Сходным образом, кортекс клеток и фрагментов во всех ситуациях натянут относительно центра. Натяжение будет ориентировать микрофиламенты кортекса: представьте себе сетку, которую кто-то растянул, все нити в ней станут ориентироваться относительно направлению натяжения. Ориентировка микрофиламентов может направлять зависимые от этих микрофиламентов движения органелл к центру. Этот довольно простой механизм пока остается гипотетическим. У нас нет пока прямых данных, подтверждающих его роль в самоорганизации. Изучение механизмов самоорганизации лишь начинается.

ГИГАНТСКИЕ КЛЕТКИ И КЛЕТОЧНЫЕ ФРАГМЕНТЫ В НАШЕМ ОРГАНИЗМЕ.

Было бы удивительно, если бы замечательная способность цитоплазмы к самоорганизации не использовалась клетками в организме для различных физиологических целей. И действительно, в нашем организме многие клетки способны проделывать самостоятельно те же реорганизации, которые мы вызываем искусственно в культуре: соединяться друг с другом в гигантские многоядерные клетки и, наоборот, отделять от себя безъядерные цитоплаз-матические фрагменты, которые способны самоорганизоваться и выполнять важные физиологические функции.

Примерами многоядерных клеток могут служить миофибриллы поперечнополосатых мышц, образующиеся путем слияния одноядерных миобластов. По всей вероятности, здесь благодаря гигантским размерам ускоряется и синхронизуется реакция мышечной клетки на нервный сигнал, вызывающий ее сокращение: такой сигнал распространяется очень быстро от нервного окончания (синапса) по всей единой мембране, окружающей многоядерную клетку.

Еще один тип многоядерных клеток - гигантские клетки инородных тел. Такие клетки образуются под кожей или в других тканях из одноядерных клеток, макрофагов, прилипших к поверхности инородного тела, застрявшего в этих тканях, например пули или иглы. Макрофаги безуспешно пытаются фагоцити-ровать инородное тело. Смысл слияния в гиганты заключается, по-видимому в том, чтобы увеличить фа-гоцитирующую поверхность. Вероятно, по сходным причинам в костной ткани становятся многоядерными особые клетки (остеокласты), которые разрушают излишнее костное вещество.

Тромбоциты крови - самый интересный и важный пример образования отделенных от клеток ци-топлазматических фрагментов, способных к самоорганизации. Тромбоциты играют центральную роль в свертывании крови, образовании тромбов - сгустков, закрывающих просвет разорвавшегося кровеносного сосуда и останавливающих кровотечение из этого сосуда [5]. Патологическое тромбообразо-вание - основа самых распространенных сердечнососудистых заболеваний, в особенности инфарктов и инсультов. Неактивированные тромбоциты, циркулирующие в крови человека, представляют собой небольшие безъядерные образования (рис. 4), покрытые мембраной и содержащие в цитоплазме много неполимеризованного актина, а также гранул разного состава. При действии химических веществ, связывающихся с рецепторами на наружной стороне их мембраны, например коллагена, тромбоциты активируются. Такая активация - начальный этап свертывания крови. На поверхности активированного тромбоцита выпячиваются многочисленные псевдоподии. У тромбоцитов, так же как и у больших ядерных клеток [2], молекулярной основой образования псевдоподий является полимеризация актиновых микрофиламентов из растворимого актина. К микрофиламентам присоединяются миозин и другие молекулы. В результате псевдоподии, как и у больших клеток, становятся сократимыми, способными прикрепляться к различным поверхностям, например к коллагеновым волокнам (рис. 4). Тромбоцит распластывается на таких поверхностях и может даже перемещаться по ним на небольшие расстояния. Гранулы, собранные в центральной части цитоплазмы активированного тромбоцита, сливаются с наружной мембраной и секретируют свое содержимое в среду (кровь или тканевую жидкость). При этом активные вещества, вышедшие из таких гранул, действуют на белки крови, стимулируя дальнейшее тромбообразование (подробнее см. [5]). Через несколько часов активированный тромбоцит, подобно клеточным фрагментам в культуре, погибает. "Родителями" тромбоцитов, циркулирующих в крови, являются особые многоядерные клетки костного мозга - мегакариоциты. На поверхности мегакариоцита образуются длинные отростки, от которых отщепляются цитоплазматические фрагменты, попадающие затем в кровь. Мы еще не знаем точно механизма отделения и упаковки таких фрагментов.

Рис. 4. Тромбоциты человека, находящиеся на разных стадиях активации. В центре - тромбоцит, выпустивший много псевдоподий и уплощивший-ся при прикреплении к твердой поверхности. Рядом - еще не активировавшийся дисковидный тромбоцит без псевдоподий. По периферии -тромбоциты с единичными псевдоподиями (самая начальная стадия активации). Сканирующая электронная микрофотография.

Препарат Е.Ю. Васильевой

Таким образом, тромбоциты можно рассматривать как фрагменты цитоплазмы, естественно образующиеся из структур противоположного типа - гигантских клеток. Эти фрагменты могут длительно сохраняться в крови в упакованном виде, но при необходимости могут однократно активироваться и самоорганизоваться, а затем, выполнив свою функцию, активировав свертывание, погибать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность к самоорганизации - важнейшее свойство цитоплазмы. Эта способность является основой распределения компонентов в каждой клетке, а также используется в организме для специальных целей - образования многоядерных клеток и естественно отделяющихся фрагментов, таких, как тромбоциты. Возможно, что механизм самоорганизации используется и в тех случаях, когда в клетке выделяются (сегрегируются) особые участки, способные к относительно самостоятельным движениям, но остающиеся связанными с остальной клеткой. Пример такого участка - пластинка цитоплазмы, образующаяся на конце растущего отростка нервной клетки, так называемый конус роста [2]. Конус роста непрерывно выбрасывает на краях псевдоподии и движется относительно самостоятельно в нужном направлении, таща за собой весь прикрепленный к нему сзади отросток. Интересно, что если отрезать конус роста от остального отростка, то он продолжает в течение некоторого времени ползать самостоятельно, то есть ведет себя как самоорганизованный фрагмент цитоплазмы.

Недавно наша группа [6] показала, что, обрабатывая большую дисковидную многоядерную клетку эпителия особым белком, выделяемым в организме некоторыми тканями (так называемым рассеивающим фактором), можно вызвать разделение этой клетки на несколько самостоятельно ползающих участков, связанных друг с другом шнурами цитоплазмы, не способными активно двигаться (рис. 5). Этот феномен - еще один пример частичной сегрегации цитоплазмы на самоорганизующиеся участки. Такая сегрегация является, вероятно, важным способом морфологических превращений клеток в организме. Конкретные пути таких превращений - интересная тема для будущих исследований.

Хотя многое в механизмах самоорганизации остается еще непонятным, очевидно, что их основой является динамика цитоскелета, в особенности микротрубочек и микрофиламентов. Эта динамическая архитектура клетки уникальна. Ничего подобного в архитектурных конструкциях, создаваемых человеком, нет. Трудно себе представить отделенный от целого здания фрагмент, самостоятельно реорганизующийся в "мини-дом". Между тем цитоплазма легко выполняет такие преобразования.

Рис. 5. Схема, основанная на данных Александровой и др. [6]. Многоядерная эпителиальная клетка (вверху) под воздействием специального белка (так называемого рассеивающего фактора) разделяется на несколько пластинчатых участков (ламеллопластов), соединенных друг с другом узкими шнурами цитоплазмы (кабелями). Каждый ламеллопласт содержит свою центросому (крестик) с отходящими от нее микротрубочками и свои органеллы. Каждый ламеллопласт способен выпускать псевдоподии и двигаться, волоча за собой присоединенный к нему кабель. Ядра есть в некоторых, но не во всехламеллопластах

ЛИТЕРАТУРА

1. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо.Ч. 1. Живые нити // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 2. С. 36-43.

2. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. 4.2. Цитоскелет, способный чувствовать и помнить // Там же. № 4. С. 4-10.

3. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. Ч. 2. Клетки строят ткань // Там же. 1997. № 5. С. 20-25.

4. Rodionov V.I., Borisy G.G. Self-centring Activity of Cytoplasm//Nature. 1997. Vol. 386. P. 170.

5. Зубаиров Д.М. Как свертывается кровь // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 3. С. 46-52.

d.AlexandrovaA.Y., Dugina V.B., Ivanovo O.Y. etal. Scatter Factor Induces Segregation of Multicellular Cells into Several Discrete Motile Domains // Cell Motility and Cy-toskeleton. 1998. Vol. 39. P. 147-158.

Юрий Маркович Васильев, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, профессор кафедры вирусологии МГУ, зав. лабораторией Всероссийского онкологического научного центра. Автор 200 научных работ, включая шесть монографий на русском и английском языках.

КЛЕТКА КАК ЧУДО АРХИТЕКТУРЫ.

Часть 4. Натяжения цитоскелета контролируют архитектуру клетки и тканей.

Ю. М. ВАСИЛЬЕВ

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

THE CELL AS MIRACLE OF ARCHITECTURE Part 4. Cytoskeletal tension controls architecture of cells and tissues

Yu. M. VASILIEV

Tension produced by interactions of actin and myosin molecules in cytoskeleton controls the organization of the extracellular matrix around the cell and reciprocally, is controlled by the rigidity of this matrix. Complex intracellular mechanisms regulate this tension. Tension may be one of the main factors integrating the organization of structures in a multicellular organism.

Изометрическое натяжение, создаваемое взаимодействием молекул актина и миозина в цитоскелете, контролирует организацию внеклеточного матрикса вокруг клетки и, в свою очередь, контролируется ригидностью этого матрикса. Это натяжение регулируется сложными внутриклеточными механизмами. Таким образом, возможно, что натяжение является одним из основных факторов, интегрирующих организацию структур многоклеточного организма.

www.issep.rssi.ru

ЧТО ТАКОЕ НАТЯЖЕНИЕ.

В предыдущей статье [1] было рассказано о том, как цитоскелет определяет внутреннюю организацию каждой клетки. В этой статье я попытаюсь показать, что роль цитоскелета еще шире, что создаваемые им силы натяжения могут определять архитектуру многоклеточных образований - тканей и органов.

С незапамятных времен известно, что мышцы создают механическое натяжение. Если точка прикрепления мышцы подвижна, то это натяжение ведет к сокращению мышцы - такое натяжение называют изотоническим. Если эта точка неподвижна из-за сопротивления материала, к которому эта мышца прикреплена, то натяжение не приводит к сокращению мышцы - такое натяжение называют изометрическим. Пример изометрического натяжения - натяжение, которое создается в мышцах руки, тянущей ручку прочно запертой двери.

Актин и миозин есть не только в мышечных клетках, но и в большинстве других клеток эукариот. Чаще всего здесь эти нити лабильны - они постоянно разбираются и собираются [2, 3]. Какова функция таких структур, наполняющих клетки? Давно известно, что сокращение актин-миозиновых структур - сила, которая двигает ползающую клетку. С наружной стороны такая клетка прикрепляется к неклеточной подложке при помощи особой адгезивной структуры - фокального контакта [4]. На внутренней цитоплазматической стороне контакт соединяется с пучком актиновых мик-рофиламентов. Сокращаясь, этот пучок тянет тело клетки вперед.

Другой пример сокращения актин-миозинового пучка - цитокинез, последняя стадия клеточного деления, когда такой пучок образуется между двумя наборами хромосом. Сжимаясь, такое сократимое кольцо разделяет две дочерние клетки.

Рис. 3. Упрощенная схема некоторых этапов регуляции актин-миозинового натяжения

Когда клетка в культуре распластана [4], то есть прочно соединена контактами со всех сторон с дном культуры - подложкой, то соединенные с фокальными контактами пучки актиновых микрофиламентов сократиться не могут, их натяжение становится изометрическим. Такая клетка все время находится в напряженном, растянутом состоянии (рис. 1-3).

В организме большинство клеток, за исключением клеток, плавающих в крови или лимфе, прикреплено друг к другу и к фибриллам неклеточного матрикса. Поэтому в таких клетках, так же как и в клетках культуры, создается изометрическое натяжение. Зачем нужно такое натяжение и какую роль оно играет в клетках и тканях? Зачем нужно поддерживать натяжения, непрерывно тратя на это энергию АТФ?

За последние годы стало ясно, что функции натяжения очень важны: оно контролирует в клетке многие процессы. Разберем ниже эти функции, но сначала коротко расскажем о том, как такое натяжение меряют, как оно возникает и регулируется. Точно мерить натяжение непросто. Пока наиболее употребительный метод - дать клеткам в культуре прикрепиться не к обычной подложке, твердому стеклу или пластику, а к эластичной тонкой пленке. Растянутая на такой пленке клетка пытается ее согнуть, пленка под клеткой образует складки, и по величине и крутизне этих складок можно оценить развиваемое клеткой натяжение (см. рис. 1). Метод непростой и не очень точный, но лучшего пока нет. Может быть, в ближайшем будущем кто-нибудь изобретет идеальный силомер, который можно будет прикреплять к отдельной клетке, не повреждая ее.

Рис. 1. Упрощенная схема натяжений, развиваемых актин-миозиновыми пучками (красные линии) в клетке с тремя цитоплазматическими отростками. Концы актиновых пучков на краях отростков прикреплены к фокальным контактам (синие линии), соединяющим мембрану клетки с волокнами внеклеточного матрикса (зеленые линии). Через фокальные контакты натяжение актин-миозиновых пучков передается на нити матрикса

Рис. 2. Распределение актиновых пучков, фокальных контактов и волокон фибронектинового матрикса на краю культивируемого фибробласта. Фотографии сделаны при помощи конфокального лазерного микроскопа, дающего трехмерное изображение клеточных структур. Окраска при помощи антител, соединенных с флуоресцирующими красителями: а - актиновые пучки (зеленые), соединенные на краю клетки с фокальными контактами, окрашенными на характерный для них белок винкулин (красный). Темные участки - тени трехмерной картины; б-актиновые пучки (красные) и волокна фибронекти-на (зеленые) на краях клетки. Препараты В. Дугиной

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИН-МИОЗИНОВОГО НАТЯЖЕНИЯ В КЛЕТКАХ

Разумеется, для создания натяжения в пучках актино-вых микрофиламентов нужно прежде всего создать такие микрофиламенты, то есть полимеризовать актино-вую нить из отдельных молекул актина. В немышечных клетках постоянно идут полимеризация и деполимеризация актиновых нитей, причем новые нити создаются в определенных местах клеток, в особенности в участках под мембраной, где они заполняют выпячивающиеся псевдоподии. Об этом подробно рассказано в статье [3].

К сетям актиновых нитей присоединяются молекулы миозина. Предполагают, что натяжение, вызываемое взаимодействием актиновых нитей с молекулами миозина, вызывает превращение неориентированной актиновой сети в пучки. Процесс можно сравнить с натягиванием рыболовной сети - в результате веревки, из которых сделана сеть, ориентируются в направлении натяжения. Таким образом, здесь натяжение выполняет элементарную формообразующую функцию - вызывает появление в клетках пучков актин-миозина, то есть самоорганизует структуру, вызывающую это натяжение. Недаром самые мощные из таких пучков давно уже назвали фибриллами натяжения (стресс-фибриллами).

Взаимодействие актина с миозином в немышечных клетках является объектом сложной регуляции. Здесь центральную роль играет обратимое присоединение фосфата к одной из цепей молекулы миозина - легкой цепи (см. рис. 3). Фосфорилирование повышает способность миозина взаимодействовать с актиновой нитью, то есть сократимость актин-миозина. Фосфорилирование легкой цепи миозина катализируется специальным ферментом киназой легкой цепи миозина. Эта киназа, в свою очередь, активируется другим ферментом - Rho-киназой. Rho-киназа активируется, когда к ней присоединяется активная форма еще одного фермента - Pvho, который катализирует распад GTP Активация Pvho через несколько промежуточных этапов может вызываться некоторыми сигнальными молекулами извне, действующими на клеточные рецепторы. Если подействовать на клетку молекулами, активирующими Pvho, то в ней вскоре появятся мощные актиновые пучки и она начнет усиленно сгибать пленку, к которой прикреплена, то есть натяжение клетки резко усилится.

У Pvho есть молекулы-родственники, также действующие на актиновый скелет, но по-другому. Например, молекула Rac не усиливает натяжения, но вызывает усиленное образование псевдоподий - полимеризацию актина. Rac также может активироваться внеклеточными молекулами через систему рецепторов.

Еще одна система, участвующая в регуляции натяжения, - система микротрубочек. Если избирательно деполимеризовать микротрубочки колхицином или сходным веществом [3], то натяжение актиновой системы резко усиливается. Вначале полагали, что микротрубочки в клетке действуют как палки, противодействующие сокращающему натяжению актина: ситуация, похожая на резиновый мешок, в который вставлены распирающие его палки. Однако сейчас становится ясно, что дело не в простом механическом действии или, по крайней мере, не только в нем. Появились данные, что рост микротрубочек в клетке как-то влияет на систему Rac-Rho, то есть на молекулярную регуляцию натяжения.

В целом эта регуляция позволяет клетке очень точно менять организацию цитоскелета и натяжений в зависимости от внешних воздействий: когда требуется выбрасывать псевдоподии на одном краю клетки и ориентировать пучки актин-миозина, чтобы ползти в нужном направлении, а когда внешние условия изменились - сделать поворот или вообще остановиться.

НАТЯЖЕНИЕ КЛЕТКИ МЕНЯЕТ ОРГАНИЗАЦИЮ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА, И, НАОБОРОТ, ИЗМЕНЕНИЯ МАТРИКСА МЕНЯЮТ НАТЯЖЕНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТА.

Вы уже знаете, что когда подложкой, к которой прикреплена клетка, делают эластичную пленку, то актин-миозиновое натяжение меняет эту подложку - сгибает ее в складки. В обычной культуре большинство клеток сами делают себе "матрац" - промежуточный слой между своей поверхностью и поверхностью дна пластикового или стеклянного сосуда, в котором они растут. Такой слой, называемый внеклеточным матриксом, образован переплетающимися волокнами, состоящими из особых белков, секретируемых клеткой. Самые известные из таких белков - коллагены разных типов. Все знают о коллагеновых волокнах в коже, рубцовой ткани, прослойках между мышцами. В культурах стандартные клетки, фибробласты, кроме коллагеновых волокон, быстро образуют еще и вторую сеть из нежных волокон, состоящих из другого белка - фибронектина. Эти нити диаметром около 5 нм часто располагаются не только вокруг клетки, но и прямо на ее поверхности, прикрепляясь концами к фокальным контактам с наружной стороны. С внутренней стороны мембраны к тем же контактам прикрепляются пучки актиновых микрофиламентов (см. рис. 2, б). Их натяжение через контакты натягивает и нити волокон матрикса, ориентируя их параллельно друг другу. Недавно разработана методика, позволяющая наблюдать движения нитей матрикса в живой культуре. Для этого ген, кодирующий фибро-нектин, соединили с геном, кодирующим белок, флуоресцирующий зеленым светом. Этот экзотический белок, выделенный из тела медуз определенных видов, широко применяется в последние годы для метки разных белков в живой клетке. В данном случае зеленым сделали белок внеклеточного матрикса - фибронек-тин. Клетки, в которые ввели химерный (сшитый из двух генов) ген "зеленого" фибронектина, естественно, стали вокруг себя делать на своей поверхности фибронектиновые волокна, которые легко наблюдать в флуоресцентный микроскоп без всяких дополнительных обработок.

Оказалось, что нити фибронектина вокруг клетки не лежат без движения, но непрерывно движутся: перемещаются, натягиваются, прикрепившись к поверхности клетки, а оторвавшись от этой поверхности через несколько минут, сокращаются в четыре раза, иначе говоря, нити фибронектина ведут себя подобно узким эластичным резиновым нитям, способным удлиняться, когда их натягивают, и резко сокращаться, когда отпускают.

Работа [5] окончательно подтвердила, что клетка не только выделяет сеть волокон матрикса, но и непрерывно меняет организацию такой сети через натяжения цитоскелета и контакты. Образно говоря, клетка все время обрабатывает и контролирует архитектуру того "дома" из нитей матрикса, который она и ее соседи построили и в котором эти клетки живут.

Вместе с тем и обратное утверждение верно: не только структура матрикса контролируется натяжением цитоскелета, но и натяжение внутри клетки зависит от "сопротивления материала", от подложки, к которой клетка прикреплена (рис. 4). Одно из доказательств этого тезиса было дано в опытах, где клетки сажали на два сорта подложек из коллагеновых волокон. Такие подложки получали, выливая раствор коллагена в чашки Петри и давая раствору затвердеть в гель - процесс, в принципе сходный с приготовлением студня в кулинарии; ведь основой студня также является желатин, то есть раствор коллагена. Часть затвердевших гелей оставляли в чашке Петри; здесь края геля были прикреплены к стенкам и дну чашки и поэтому были растянутыми, жесткими, несгибаемыми. Другие гели вырезали из чашки и позволяли им свободно плавать в жидкой среде. Такие гели были мягкими и легко сжимались. Когда клетки сажали на эти варианты коллагенового матрикса, результаты были разными: на закрепленном "ригидном" коллагене клетки делали большие актино-вые пучки и контакты, то есть, по-видимому, развивали сильное изотоническое натяжение актинового цитоскелета. На мягком плавающем коллагене изменения не развивались; клетки сжимали гель, не делая больших актиновых пучков (см. рис. 4). Эти и другие подобные опыты показывают, что клетка чувствует сопротивление того материала, к которому прикрепляется, и перестраивает свой актиновый цитоскелет и контакты с этим матриксом в зависимости от такого сопротивления: чем жестче материал подложки, тем больше натяжение актин-миозина и тем прочнее и больше контакты. Мы еще не понимаем механизмов этих удивительных перестроек, которые могут быть очень быстрыми. Может быть, здесь включаются специальные рецепторы натяжений, реагирующие на растяжение мембраны клетки?

Рис. 4. Цитоскелет и контакты точно адаптируются к сопротивлению материала матрикса, к которому клетка прикреплена. Сопротивление материала обозначено зелеными стрелками. Вверху - клетка на жестком матриксе: актиновые пучки (красные) и фокальные контакты (синие) хорошо развиты. Внизу -клетка на мягком матриксе: пучки и контакты развиты слабо

В некоторых случаях за быстрыми реакциями на натяжение следуют и более длительные и радикальные перестройки. Например, обычные фибробласты синтезируют так называемую немышечную форму актина, тогда как при некоторых условиях, в частности на жестком коллагене, клетки могут начать синтезировать другую, несколько отличную по структуре форму актина, так называемый гладкомышечный актин. Этот актин, встроившись в пучки микрофиламентов, развивает, взаимодействуя с миозином, более сильное натяжение. Такие изменившиеся фибробласты называют миофиб-робластами. Изучение механизмов этой сложной перестройки только начинается.

В целом, развивая и меняя натяжения, клетка непрерывно приспосабливается к своему окружению, матриксу и приспосабливает структуру этого матрикса к себе. Структура каждой клетки и матрикса динамично взаимосвязаны. Через изменения матрикса каждая клетка может менять организацию других клеток, даже прямо не связанных с ней контактами. Такая взаимосвязь - основа единства клеток и матрикса каждой ткани, основа интеграции ткани в единое целое.

НАТЯЖЕНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТА И ИЗМЕНЕНИЯ ФОРМЫ ОРГАНОВ.

Натяжение актин-миозина определяет организацию цитоскелета и контактов самой клетки и окружающего их матрикса в культуре. Естественно предположить, что натяжения клеток играют важную роль и в организме, в особенности в процессах морфогенеза, то есть в образовании и регенерации органов и других структур определенной формы. Простой пример морфогенеза - заживление наружной раны. В такую рану уже через несколько дней проникают из окружающих тканей фиб-робласты и сосуды, образуя так называемую грануляционную ткань. Фибробласты вырабатывают в ране фибронектиновый и коллагеновый матрикс, прикрепляются к нему и начинают синтезировать гладкомы-гпечную форму актина. Развивая натяжение, эти мио-фибробласты сжимают матрикс и всю рану, которая позже полностью заживляется в результате размножения эпителия кожи и других местных клеток (рис. 5).

Сжатие миофибробластами раны - лишь один из случаев действия клеточных натяжений в организме. Можно думать, что натяжения цитоскелета играют критическую роль в развитии разных тканей и органов: образовании складок и выростов эпителиальных пластов, изменениях формы мышц, костей и т.д. За последние годы появилось много работ, где исследователи пытаются объяснить натяжениями клеток процессы развития. В частности, разработана детальная теория (или модель, как нынче модно говорить), которая объясняет натяжениями цитоскелета нервных клеток образование самого сложного по форме из существующих в природе органов - нашего мозга, например образование складок (извилин) коры головного мозга. К сожалению, все эти модели показывают лишь возможные пути развития органов, показывают только, где надо искать роль натяжений в развитии, какими должны бы быть натяжения клеток в развивающихся органах для того, чтобы придать этим органам свойственную им форму. Остается главное - показать, что такие натяжения цитоскелета действительно в клетках этих органов реально существуют и играют постулируемую теориями роль. Эта сложная работа только начинается.

Рис. 5. Схема сокращения раны натяжениями мио-фибробластов: а - кожная рана (эпидермис показан коричневым цветом), в которую выползли миофиб-робласты (красные), прикрепившиеся к образованной ими же сети волокон матрикса (зеленые); б - сокращение актин-миозинового цитоскелета миофиб-робластов и вызванное им сжатие сети волокон матрикса вызвали уменьшение площади раны

НАТЯЖЕНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТА И КОРЕННЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОГРАММ.

Как мы знаем, клетки в организме и культуре способны под влиянием определенных сигналов переключаться с одной программы работы на другую: клетка может начать или прекратить размножение, превратиться из менее специализированной в более специализированную (дифференцироваться) и, наконец, включить программу самоубийства (апоптоза).

При каждой из таких перестроек меняется большинство синтезов и других биохимических процессов. В клетке происходит глобальная перестройка всей ее деятельности. Есть данные, которые позволяют предположить, что одним из факторов, вызывающих такие перестройки, могут быть изменения натяжения цитоскелета. Например, нормальные фибробласты, уплощенные и растянутые на подложке, активно размножаются, но стоит их отделить от подложки, как клетки сжимаются сокращением актин-миозиновых структур в шары и размножение прекращается, а нередко наступает и гибель "бездомной" клетки - апоптоз. Некоторые типы эпителиальных клеток, например клетки молочных желез, растянувшись на жестком коллагеновом геле, размножаются, но не синтезируют белки молока. Напротив, на плавающем мягком коллагене эти клетки сжимаются и начинают синтезировать специализированные белки, то есть дифференцируются. Какую конкретную роль играют изменения натяжения цитоскелета в этих перестройках клеток от размножения к гибели или дифференцировке? Это пока неясно. Сейчас многие исследователи начали активно работать в этой области.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Развитие наших взглядов на архитектуру отдельной клетки можно условно разделить на три этапа. Сначала казалось, что клетка - это мешок, где стенка (мембрана) окружает жидкий бульон (цитозоль), в котором плавают отдельные "клецки" - органеллы (ядро, митохондрии, лизосомы). На втором этапе было обнаружено несколько сетей фибрилл цитоскелета, проходящих через всю клетку от мембраны до ядра и направляющих движения органелл. И наконец, в последние годы начали понимать, что речь идет не о сети, но о динамичных фибриллах, которые развивают и передают механические натяжения. Клетка, кроме всего прочего, оказалась сложной системой сбалансированных сил. Некоторые ученые, например А. Харрис и Д. Ингбер в США, Л. Белоусов в нашей стране, уже давно говорили о роли таких натяжений, но их природа и значение становятся ясными лишь теперь. Человек тоже умеет делать постройки, где крыша из эластичной пленки растянута на опорах (вспомним легкие разбираемые выставочные павильоны). Однако конструкция клетки гораздо сложнее: ведь ее строительные элементы, нити цитоскелета, динамичны, они постоянно возникают и распадаются, а сила натяжений постоянно меняется под влиянием регуляторных систем, таких, как Rho и Rac.

Новые представления об организации цитоскелета начинают понемногу менять наши взгляды не только на структуру клетки, но и на происходящие в ней молекулярные процессы. Не могут ли изменения натяжений нитей цитоскелета быстро передавать непосредственно какие-то сигналы с одного конца клетки на другой? Не может ли передача сигналов с одной молекулы на другую осуществляться не при столкновениях молекул в растворе, а по цепи молекул, прикрепленных к нитям актина, причем изменения натяжения могут менять расположение этих молекул и целых органов?

Как меняются натяжения актин-миозиновой системы при опухолевых трансформациях клеток и как эти изменения отражаются на нарушениях клеточных регуляций? Эти предположения требуют проверки. Биологи начинают думать о клетке по-новому.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 3. Клетка единая, но делимая // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. № 8. С. 18-23.

2. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 1. Живые нити//Там же. 1996. № 2. С. 36-43.

3. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч. 2. Ци-тоскелет, способный чувствовать и помнить // Там же. № 4. С. 4-10.

4. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. П. Клетки строят ткань//Там же. 1997. № 5. С. 20-25.

5. Ohashi Т., Kiehart D., Erickson H.P. Dynamics and Elasticity of the Fibronectin Matrix in Living Cell Culture Visualized by Fi-bronectin - Green Fluorescent Protein // Proc. Nat. Acad. Sci. 1999. Vol. 96. P. 2153-2158.

Рецензент статьи Г. И. Абелев

Юрий Маркович Васильев, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, профессор кафедры вирусологии МГУ, зав. лабораторией Всероссийского онкологического научного центра. Автор 200 научных работ, включая шесть монографий.